Purification Lysozyme

Purification et dosage de la phosphatase alcalinePurification et dosage de la phosphatase alcaline Dimère de la phosphatase alcaline d E.coli Table des matières Fiche de synthèse I. Genèse du projet ................................................................................................................. 1 II. Présentation du matériel et des méthodes ........................................................................... 2 II. 1. Estimation de la quantité de protéines par méthode

coli cultivée à 37°C dont le milieu de culture est éliminé par centrifugation. Le culot bactérien obtenu est ensuite resuspendu dans une solution I qui contient entre autres de l’EDTA et du lysozyme. L’EDTA permet de chélater les cations divalents (Mg2+ et Ca2+) afin d’éviter l’activation des DNases, et le lysozyme permet la digestion des parois bactériennes en coupant les liaisons du peptidoglycane. On ajoute ensuite la solution II contenant du NaOH qui augmente le pH et dénature l’ADN chromosomique

pour empêcher la formation de trouble résultant de la présence dans la bière de protéines. Origine animale : - Lysozyme (originaire du blanc d'œuf). il est utilisé comme agent bactériostatique, c'est à dire que cet enzyme est capable d'hydrolyser les liaisons glucidiques des membranes de certaines bactéries. Empêche la bactérie de développer sa paroi cellulaire donc lysozyme = anti-bactérien La plupart de ces enzymes est utilisés dans les usines de détergeant, dans les papeteries, dans l'agroalimentaire

réalisera ensuite une digestion du plasmide avec des enzymes de restriction libérant l’insert et une PCR de l’insert  SNAP avec les amorces définies dans le TD. Les résultats seront visualisés sur gel d’électrophorèse coloré au bromure d’éthidium. Purification de l’ADN plasmidique (protocole Qiagen) Aliquoter P1 250 L, P2 250 L, P3 350 L, PE 750 L, EB 75 L Expliquer : pipetman, cahier de manip, centrifugeuse But : purifier l’ADN à partir de 3 mL de culture saturée de cellules Xl1blue contenant

sont enfin lavés dans du NaCl 0,15 M et recentrifugés 10 min dans les mêmes conditions. Ils forment après cette deuxième centrifugation un culot blanc au fond du tube. | |   Dans le cas des bactéries, la lyse est facilitée par l'action du lysozyme qui hydrolyse le muropeptide, couche rigide de la paroi assurant la protection osmotique de la cellule en milieu hypotonique. La dissociation des protéines, notamment des histones des eucaryotes, est réalisée en utilisant un détergent dénaturant

Oligonucléotides............................................................................................. 50 D. Préparation d’ADN plasmidique........................................................................ 50 E. Digestion enzymatique de l’ADN et purification de fragments......................... 51 F. Ligation vecteur-insert ....................................................................................... 52 G. Marquage de sondes nucléiques à la digoxygénine (DIG)............................

Elimination des protéines et Acides Nucléiques * Purification de l'ADN plasmidique. 2.1 Croissance bactérienne Les bactéries sont mises en croissance en milieu riche, sous agitation vigoureuse. La croissance est effectuée à partir d'une culture pure de micro-organisme. 2.2 Lyse cellulaire Les cellules sont traitées par le lysozyme qui affecte l'intégralité de la paroi cellulaire

CONSTRUCTION DU PLASMIDE RECOMBINANT pCR 2.1-TOPO- entD 1.1- ISOLEMENT ET amplification de entD par pcr 1.1.1. LYSE CELLULAIRE AUX MICROONDES1.1.2. realisation de la PCR1.1.3. Purification de l’amplicon 1.1.4 VISUALISATION et QuantifIcAtion de l’amplicon PAR Electrophorèse SUR GEL D'AGAROSE. 1.2. Insertion de l’amplicon DANS pCR 2.1-TOPO 1.3. - TRANSFORMATION de Escherichia

grandeurs peuvent être définies à partir de l’activité catalytique : L’activité spécifique Quantité de produit (en μmoles) formés / unité de temps (en général la minute) / mg de prot. = mesure du degré de pureté Sa valeur augmente au cours de la purification. Valeur max quand l’enzyme est pure.  μmol/min/mg = UI/mg Activité molaire Nombre de moles de substrat transformées / mole d’enzyme / minute Nombre de rotations (kcat) = turnover Nombre de molécules de substrat transformées/molécule d’enzyme/seconde

besoins de chaque organelle. Zone d’activité d’enzyme en fonction du pH : Pepsine, trypsine, lysozyme (courbes). L’activité catalytique des enzymes est très sensible au pH. Le pH optimum d’une enzyme est l’une de ses plus importantes caractéristiques. Pepsine : enzyme de la digestion des protéines, active dans le suc gastrique. Trypsine : enzyme protéolytique qui agit dans l’intestin grêle. Lysozyme : digère les parois bactériennes (présente dans les larmes). Systèmes tampons des organismes