Purification Lactate Déshydrogénase

1 LA LACTATE DESHYDROGENASE: PURIHCATION PARTIELLE PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITÉ La lactate deshydrogénase catalyse la réaction: L lactate + NAD+ < - > pyruvate + NADH +H+ La lactate deshydrogénase (LDH) est un tétramère constitué de quatre sous-unités de 35 kDa. Chez les mammifères deux types différents de sous-unité existent, le type* M (pour muscle) et le type H (pour heart), ce qui correspond à cinq formes d' isoenzymes tétramériques: MH3, H4 M4, M3H, Bien que ces formes

La Lactate déshydrogénase. Lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d'affinité La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme qui catalyse la conversion réciproque de la pyruvate et de la lactate accompagnée de la conversion concomitante du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de 4 sous unité (isoenzyme) différents de par leurs constances cinétiques et leurs pH isoélectriques. Introduction : Dans cette manipulation nous cherchons à séparer

 Série ABB 3 Compte rendu de Biochimie Purification et étude cinétique de la LDH Année universitaire 2013/2014 DUT 1 Semestre 2 Sommaire Introduction p.1 I / Principe de la séparation p.1 1) Méthodes p.1 a – Préparation de l’extrait brut b- Chromatographie d’affinité et d’exclusion 2) Résultats et discussion p.5 a – Chromatographie d’affinité b- Chromatographie d’exclusion

compétitifs 16 Intérêt medical • L’éthanol est utilisé comme inhibiteur compétitif, dans le traitement de l’empoisonnement au méthanol. Dans l’organisme, le méthanol est métabolisé en formaldehyde (dangereux car trés toxique), par une alcool déshydrogénase. L’éthanol rentre en compétition avec le méthanol pour la même enzyme. • L’inhibition compétitive des enzymes est une stratégie souvent adoptée dans le développement de médicaments type antibiotique. Exp: les sulfamides rentrent en compétition

l'enzyme qui catalyse l'interconversion du lactate et du pyruvate: CH3-CO-COO- + NADH + H+  CH3-CHOH-COO- + NAD+. Cette réaction est centrale dans le fonctionnement du métabolisme énergétique de la cellule puisque le pyruvate est le pivot qui relie la glycolyse et le cycle de l'acide citrique (cycle de Krebs). En présence d'oxygène, le pyruvate pourra entrer dans cette dernière voie métabolique mais, en condition anaérobique, il s'accumulera sous forme de lactate. Il n'est donc pas surprenant que les

Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) : MM tr (min) Aldolase 145000 10,4 Lactate déshydrogénase 135000 11,4 Phosphatase alcaline 80000 18,4 Ovalbumine 45000 26,2 Lactoglobuline 37100 28,6 1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous ? 2 - Pour la glucokinase, tr =

plupart des enzymes = protéines Exception : certains acides ribonucléiques, les ribozymes holoprotéines (uniquement des a.a.) monomériques Exemple : la ribonucléase à 124 résidus d’AA, M=13700 Da holoprotéines oligomériques Exemple : La lactate déshydrogénase à 4 protomères, M=150000 Da hétéroprotéines Partie protéines + Partie non protéines Apoenzyme (partie prot) + cofacteur ou coenzyme = catalyse Cofacteur : corps chimique intervenant obligatoirement dans une réaction enzymatique : pour transporter

Glycéraldéhyde 3-P Glycéraldéhyde 3-P PEP Acétyl P Pyruvate CO2 Pyruvate Acétaldéhyde Acétaldéhyde Lactate Ethanol Ethanol Fermentation malolactique ou TML NAD+ L-Malate NADH,H+ Malate déshydrogénase Oxaloacétate CO2 NAD+ CO2 CO2 NADH,H+ Enzyme malolactique NAD+ L-Lactate Pyruvate NADH,H+ NAD+ D-Lactate Les coques lactiques (1/4) Type fermentaire Molécules synthétisées à partir des glucides Type de groupements

Fonctionnement du cycle de Krebs en aérobiose et en anérobiose _________ 51 Rôle du cycle de Krebs dans la sporulation __________________________ 53 A la jonction entre la glycolyse/néoglucogenèse et le cycle de Krebs ________ 54 Le complexe pyruvate déshydrogénase (EC 1.2.4.1) pdhABCD __________ 54 La pyruvate carboxylase pycA (EC 6.4.1.1) __________________________ 54 La phosphoénolpyruvate carboxykinase pckA (EC 4.1.1.49) _____________ 55 L’enzyme malique (EC 1.1.1.38-40)________________________________

échantillons pour les analyses microbiologiques 39 3.1 Les dilutions 39 3.2- Milieux de cultures 41 3 3-3 Conditions de culture 44 3.4. Dénombrement et isolement 44 3-4-1-Dénombrement de la Flore Lactique totale 45 4. Isolement et purification des bactéries lactiques 45 4-1- Dénombrement et Isolement des Lactocoques 45 4-2- Dénombrement et Isolement des Leuconostoc 45 4-3- Denombrement et Isolement des Lactobacilles 45 5. Tests morphologiques 46 5.1. Coloration de Gram 46