Électrophorèse sur gel

manipulation nous cherchons à séparer les différents monomères de l’enzyme tétramérique. Pour cela nous allons procéder par différents procédés tels que : L’extraction, la purification, la mesure de l’activité enzymatique par spectrophotométrie, des électrophorèses et pour finir des dosages de protéines. L’extraction et la purification : vont nous permettre d’obtenir une enzyme lavée de toutes les molécules « parasites » (comme les protéines ou les inhibiteurs). La mesure de l’activité par spectrophotométrie :

séparés en gel d'agarose ou, si les fragments sont de petite taille, en gel de polyacrylamide. • Après dénaturation de l'ADN et transfert par capillarité ou par électrophorèse, sur des filtres de nitrocellulose ou de nylon à l’aide de la sonde spécifique l’ADN sera détecté. 1 - Après avoir digéré l'ADN à étudier par une enzyme de restriction, on obtient un mélange de très nombreux fragments de restriction. On soumet ces fragments à une électrophorèse pour les faire migrer dans un gel de haut

vert (18 points) Cette technique permet de contrôler la qualité du malt en vue de son utilisation en brasserie. Elle s'effectue par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Première dimension: isoélectrofocalisation (I.E.F.) en gel de polyacrylamide entre pH 2,5 et 7,0. Deuxième dimension perpendiculaire à la précédente : électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions non dénaturantes (P.A.G.E.). 2 1.2.1. Première étape : isoélectrofocalisation (document 3)

caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnait ainsi un site spécifique. Egalement on fait agir une Dnase et une Rnase toujours sur cet ADN extrait. Et ces ADN extraits traités différemment sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose, on analyse la présence et la taille des acides nucléiques contenus dans la préparation, mais on détermine également, où ont lieu les sites de restriction spécifique de l’enzyme utilisée. Ceux-ci sont révélés par le bromure d'éthidium

l’isopropanol. Au cours du TP, une partie de l’ADN extrait va subir divers traitements comme l’hydrolyse par une enzyme de restriction, le traitement avec la RNase et la DNase I. Puis chacun de ces traitements sera ensuite déposé puis analysé par électrophorèse sur gel d’agarose. Ils seront révélés par le bromure d’éthidium qui est un colorant et dont la fluorescence augmente en présence d’ADN. Grâce à cette technique, la présence et la taille des acides nucléiques va pouvoir être étudiée, ainsi que la localisation

l’albumine sérique de bovin (BSA) et une protéine inconnue Y à déterminer. Une première manipulation consistera à faire migrer par électrophorèse, de la BSA, des isoLDH, des protéines inconnues Y et un marqueur de taille, tous monomères, sur un gel de migration dénaturant SDS. La deuxième manipulation consistera quant à elle à faire migrer, toujours par électrophorèse, des isoLDH et de la BSA natives sous forme de polymères sur des gels de migration non dénaturants ND à différents pourcentages d’acrylamide

final. On aura dans ce cas deux valeurs de concentrations pour un échantillon. 5- Appliquer le cas échéant le facteur de dilution. 6- Exprimer le résultat final en utilisant l’unité demandée. TP de BIOCHIMIE – Licence BB L2 SB4070 TP I pH, électrophorèse T.P. I. PROPRIETES IONIQUES DES ACIDES AMINES Rappels En solution aqueuse, les acides aminés à chaîne latérale non ionisable neutres peuvent exister sous trois formes ioniques différentes selon la valeur du pH de la solution: NH3+ R CH COOH

TP : Recherche d’allèles mutés pour la mucoviscidose à l’aide d’une électrophorèse d’ADN La mucoviscidose est une pathologie génétique sévère, qui se traduit par une augmentation de la viscosité des sécrétions corporelles, elle atteint particulièrement les voies respiratoires et digestives. En cause, des mutations, plus de 2000 répertoriées qui altèrent le fonctionnement du gène CFTR affectant la synthèse de la protéine transmembranaire CFTR. L’objectif

mettre en place la digestion d’ADN plasmidiques issus de deux clones différents, par différentes enzymes de restriction et ainsi pouvoir déterminer si le clonage a réussi. Pour cela, nous allons réaliser la digestion de l’ADN puis effectuer une électrophorèse. Matériel et méthodes : Pour faire ce tp, nous allons utiliser des ADN plasmidiques issu de deux clones différents pUC-L1 et pUC-L2 fournis en solution à 0,5 µg d’ADN/µl. Nous allons également utiliser deux enzymes de restriction, soit

* pGEX + RNase * pGEX + EcoRI * pGEX + RNase + EcoRI * pGEX-IDH + RNase * pGEX-IDH + RNase + EcoRI * pGEX-IDH + RNase + EcoRI + BamHI * Electrophorèse horizontale en gel d’agarose : L’ADN plasmidique est chargé négativement : entraîné par un champ électrique, il migre vers l’anode (pôle positif). Le gel d’agarose constitue un réseau de mailles permettant de séparer des composés en fonction de leur taille ; la fourchette de séparation dépend de la concentration en agarose