Électrophorèse sur gel

COMPTE RENDU N°1, ENZYMOLOGIE : La lactate déshydrogénase, purification partielle par chromatographie d’affinité But : Purifier la lactate déshydrogénase. Nous disposons d’un extrait de tissu bovin fœtal. Purification partielle sur gel de bleu de Cibacron et mesure de l’activité enzymatique 1ère étape : Vérifier la présence de l’enzyme dans notre tissu. Réaction d’oxydation du lactate (dans les mitochondries) : Lactate + NAD + Pyruvate + NADH,H+ Si notre

bleu de Cibacron qui présente une analogie avec le cofacteur NADH, le ligand naturel de la lactate déshydrogénase, est fixé par liaison covalente sur des billes de gel (phase stationnaire). Puis on effectue un lavage avec un tampon afin d’obtenir des conditions chimiques favorables à la fixation de l’enzyme sur le gel. ➢ Electrophorèse - En milieu dénaturant (SDS-Page) L’électrophorèse en milieu dénaturant permet de séparer les différentes protéines contenue dans la fraction de départ et dans

suivie d’une évaluation, sur gel d’agarose, de la quantité d’ADNc TAT purifié. Pour cela un gel d’agarose est préparé selon les volumes suivants : Bromure d’éthidium(Bet) 0.8µL 80mL 4µL Volumes Tableau I : Composition du gel d’Agarose Le Bet est un agent intercalant qui va se fixer entre les bases de l’ADN et va nous permettre de voir (aux UV) où a migré le contenu du puit. L’ADNc purifié des différents groupes est déposé dans chaque puits ainsi qu’un marqueur de taille. Gel d’agarose 1% Tampon TAE (1X)

amplification de entD par pcr 1.1.1. LYSE CELLULAIRE AUX MICROONDES1.1.2. realisation de la PCR1.1.3. Purification de l’amplicon 1.1.4 VISUALISATION et QuantifIcAtion de l’amplicon PAR Electrophorèse SUR GEL D'AGAROSE. 1.2. Insertion de l’amplicon DANS pCR 2.1-TOPO 1.3. - TRANSFORMATION de Escherichia coli TOP10 1.3.1 - PREPARATION DES CELLULES COMPETENTES. 1.3.2 - REALISATION

de l'extraction Analyse sur gel d'agarose révélée au bromure d'éthidium * Par électrophorèse sur gel d'agarose, on peut analyser la présence et la taille des acides nucléiques contenus dans la préparation. Ceux-ci sont révélés par le bromure d'éthidium, un colorant dont la fluorescence augmente très sensiblement quand il interagit avec l'ADN. Dans le cas d'une préparation d'ADN plasmidique, on observe sous UV une ou plusieurs bandes colorées discretes dans le gel, correspondant à l'ADN du plasmide

Comment met on en évidence le polymorphisme de l'ADN L'ADN est extrait d'un petit échantillon Il est coupé par une enzyme de restriction appropriée Les fragments obtenus, caractéristiques de chaque personne, sont séparés, selon leur taille, par électrophorèse Certains fragments bien précis sont séparés à l'aide d'une "sonde" radioactive Leur position, variable selon les individus est alors visualisée sur un film photographique Pour mieux comprendre et visualiser le déroulement voici les étapes

LES TECHNIQUES LIEES AUX ACIDES NUCLEIQUES Sommaire Préparation des acides nucléiques Extraction/Purification Les enzymes agissant sur les acides nucléiques Dosage et conservation Synthèse in vitro Séparation des acides nucléiques Electrophorèse Ultracentrifugation Détection, caractérisation et identification des acides nucléique Marquage et suivi des acides nucléiques Marquage radioactif Marquages froids : colorimétrie, fluorescence ; chimioluminescence ; Hybridation moléculaire

avec une étiquette His6 dans un vecteur pQE30. Diverses techniques nécessaires au sous-clonage seront abordées : PCR, digestion par des enzymes de restriction, séparation de fragments d’ADN sur gel d’agarose, culture de bactéries. La  SNAP sera purifiée par chromatographie d’affinité et analysée sur gel d’acrylamide par la méthode SDS-PAGE. Elle sera identifiée par des anticorps spécifiques (techniques de Western blot et d’ELISA). Concepts clefs et difficultés attendues : Distinguer techniques

les deux phases liquides. La chromatographie d’exclusion : On l’appelle également chromatographie d’exclusiondiffusion, tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche, les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel. Gillet Steve, D.Sc. -74- La chromatographie et l'électrophorèse. Les chromatographies d’adsorption La chromatographie d’adsorption

sanguins labiles. Bac +3. Les empreintes génétiques : réalisation d'une électrophorèse. Site : le southtern blot université Rouen (important) Le procédé : l'ADN extrait de plusieurs cellules nuclées est découpé par des enzymes (?) en fragments de tailles variées : la taille est spécifique de l'information génétique de chaque individu. Ces fragments sont ensuite séparés en fonction de leur taille, par migration sur un gel d'électrophorèse(?). Présentation de la PCR : L'ADN est fait de 4 nucléotides