Électrophorèse sur gel

1 ADN RECOMBINANT I. TECHNIQUES D’ÉTUDE DE L’ADN 1. Purification de l’ADN 1. Caractéristique de l’ADN L’Adn est en double hélice, il possède 10 nt/ tour d’hélice , 3,4nm/tour Le génome d’E. Coli possède un seul chr soit environ 4.10⁶ paires de bases ( pb ) La taille disproportionnée de la molécule d’Adn entraîne une grande sensibilité aux cassures mécanique lors de l’extraction. Étapes : Lyse des cellules Traitements chimiques, enzymatiques et physiques    Centrifugation 1. Pour la lyse

lasérothérapieb) Comparaison d'une électrophorèse d’un sérum de lapins infectés et d'un lapin non infectéc) Comparaison des tests d'agglutinations réalisés avec le sérum demain individu infecté par une bactérie (ex : Brucella) en présence de sang d'un individu infecté et en présence de sang d'un sujet non attendsd) Réalisation du test d’Outcherlony (= immunodiffusion sur gel) pour mettre en évidence l'action des anticorps produit après une infection à un

dans une famille où les parents ne sont pas atteints de drépanocytose mais l’enfant 1 est atteint. père mère enfant 1 enfant 2 Électrophorèse des allèles du gène codant l’hémoglobine des différents membres de la famille. Rq : L’électrophorèse est une technique de séparation des molécules selon leurs propriétés physico-chimiques en les faisant migrer dans un gel. Les différents allèles d’un gène migrent différemment, ce qui permet de les identifier. Ici, l’allèle HbS du gène codant l’hémoglobine

dont une est fixée sur bille de chitine • Électrophorèse de proteines en conditions dénaturantes : But : Séparer les proteines accrochées aux billes selon leur masse moléculaire afin de mieux visualiser l’interaction. Principe : On décroche le complexe protéines recombinantes – anticorps des billes grâce à du SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) qui est présent dans le tampon de charge. Puis après dépôt dans les puits d’un gel de polyacrylamide on fait migrer ce complexe dans un

qui permet d'augmenter la densité des produits de PCR. Ainsi lors du dépôt, les produits de PCR tomberont au fond des puits et remplaceront alors les tampons. Une fois le programme de PCR terminé, nous ferons migrer nos produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 4%. L'agarose permet de créer un réseau maillé permettant une séparation des produits de PCR. Les fragments les plus légers migreront le plus loin. Le pourcentage élevé de 4% pour l'agarose permet une haute résolution (réseau maillé

o Amplification en chaîne par polymérase (ACP/PCR) : rôle des amorces, de la taq polymérase, de la solution d’amplification; que se passe-t-il dans le thermocycleur à chaque température; calculer le nombre de copies d’ADN fabriquées. o Électrophorèse sur gel : caractéristiques permettant de séparer les molécules, positionnement des puits par rapport aux bornes, rôle des marqueurs de poids moléculaires, utilisation des distances de migration pour réaliser une droite d’étalonnage et utilisation

poly(dN) Chapitre 9 : 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 9.10 9.11 9.12 9.13 Caractérisation des acides nucléiques Principaux oligonucléotides Spectres UV des bases nucléiques Spectre UV des acides aminés Dosage des acides nucléiques Electrophorèse des acides nucléiques Sonde nucléique (définition) Hybridation d’une sonde Calcul de la Tm Southern blot Drépanocytose (anémie falciforme) Marquage : nick translation Marquage : random priming Marquage : terminal transferase 2006 - 2007

3) ta réatisation une amplification on chaine de VADN Lobjectifest de réaiser une amplification suffisante dun fragment dADN pour que celu-ci soit identifiable lors dune électrophorese" dADN. Les amorces sont choisies pour ciblr le fragment dADN, recherché, Si ce fragment est amplifié, a quantté sera tlle quil deviendra detectable, Sl riest pas amplifié, I restera indétectabe, lest impératif de bien respecter le protocole et de tra- vailler dans des conditions trés stricts (avec des gants ‘Rotamment):

Procédure 1 2 3 Grains de blé 6 stades: 80°CJ, 180°CJ, 240°CJ, 700°CJ, Grains matures et épi Extraction des ARNs RT-PCR ADNc Vérifier la qualité des ARNs sur gel d’ agarose Broyage à l’ azote liquide à -196°C ARNr 28S ARNr 18S Test d’ hybridation des amorces Amplification du fragment d’ ADNc d’ intérêt Migration sur gel d’ agarose Etude transcriptomique Test d’ hybridation des amorces sur plasmide • Le principe de ce test est d’ amplifier notre fragment d’ ADN d’ intérêt inséré

leurs affinités plus ou moins importantes avec les deux phases ( phase mobile et phase fixe ). Électrophorèse : analyse de l'EPO La chromatographie n'est pas efficace quand il s'agit de détecter des grosses molécules comme l'EPO elles ont du mal à migrer sur un support solide, ce qui empêche une bonne séparation, on utilise alors l'électrophorèse. Au cours d’une analyse par électrophorèse, des espèces chargées migrent à travers une solution d’électrolyte, sous l’effet d’un champ électrique