Utilisation des cellules:
- A549
- NIH-3T3
-CEMx174
-THP-1
- HEK-293
- PolyT2-L
- Clones 3, 4, 7 et 9

Figure 5: Cellules utilisées sur lames de cytospin®.

Immunomarquage sur cellules "cytospinées"

J'ai également effectué des marquages par immunofluorescence sur la protéine d'intérêt et sur la protéine eGFP, afin de vérifier l’expression de l’eGFP à la membrane des cellules transfectées.
Pour cela, on a effectué les tests sur des cellules qui, au préalable, ont subit une centrifugation grâce à un cytospin® (Cytospin® 4 Shandon, Fisher Scientific). Cette méthode est basée sur la projection et la fixation des cellules sur des lames de verre simples grâce à la vitesse. La figure 5 présente les différentes cellules utilisées.
Tout d'abord, les lames sont maintenues dans des "coverplates" et une cassette (figure 6) grâce à une solution de PBS. Ce montage permet d'avoir des échantillons toujours humides, à condition de vérifier l'absence de bulles entre la lame et la "coverplate". Pour se faire, on effectue un rinçage au PBS; si le liquide s'écoule trop vite, cela indique la présence de bulles.
Une fois que toute la solution s'est écoulée, on introduit 100 µL de KMnO4 à 0.06% pendant 15 minutes à température ambiante, cela va permettre d'éteindre la fluorescence naturelle de l'eGFP.
On rince au PBS puis on bloque les sites non spécifiques avec 100 µL de la solution de PBS-BSA à 1% pendant 1h à température ambiante.
Un dernier rinçage est nécessaire avec une solution de PBS-Tween à 0.01% avant de déposer les anticorps primaires. L'anticorps de lapin anti-GPRAB (A2, Interchim) est dilué au 1/1000 et l'anticorps de poulet anti-GFP (ab13970, Abcam) est dilué au 1/500 dans la solution de PBS-BSA à 1%. On dépose 100 µL de ces solutions d'anticorps sur les lames et on laisse incuber toute une nuit à 4°C.
Le deuxième jour, on rince les lames avec le PBS-Tween à 0.01% puis on procède à la dilution des anticorps secondaires. On utilise:
- un anticorps d’âne