TP1 : Extraction d’ADN et amplification

1 . Extraction d’ADN de bénitier de Raivavae (RR1) suivant le protocole (adapté de promega)
2. La figure 1 nous présente la photo d’un gel d’électrophorèse obtenue après extraction d’ADN de manteau d’un même bénitier. B1 à B5 sont des extraits d’ADN effectuée par 5 étudiants différents. M est le marqueur de taille (Lambda Hind III ). On voit que pour B2, B4 et B5 ont pas de smear, ce qui signifie qu’il n’y a surement pas d’ADN ou peut-être que l’extraction n’a pas fonctionner. Il es possible de vérifier la présence d’ADN grâce au mesure d’absorbance faite par un spectrophotomètre. Nous voyons aussi que pour B1 et B3, on a des smears donc on a présence d’ADN qui est de moyenne qualité. L’ADN de base pour B1 a un smear plus long et plus visible que celui de B3 donc l’ADN de B1 est plus fragmenté que l’ADN de B3 (étudiant 3). Cette étape est importante pour la vérification de l’efficacité de l’extraction.
3 . Principe de la PCR
But de la PCR : obtenir par réplication des copies multiples d’un fragment d’ADN sélectionnée d’un extrait.
Nôtre mélange réactionnel contient des amorces, des ADN polymérases (Taq polymérase), l’extrait d’ADN contenant les brins à amplifiés, des dNTP en excès (bases nécessaire à la formation des nouveaux brins).
1° Dénaturation de l’ADN :
Par chauffage, les liaisons hydrogènes localisées entre les deux brins d’ADN ne vont plus pouvoir les liés. Il y a dénaturation du double brin d’ADN en simple brin.
2° Hybridation :
L’amorce (séquence courte monocaténaire de 20 bases) va s’accoler au brin d’ADN par complémentarité. Cette complémentarité va permettre par la suite la réplication de l’ADN. La température idéal hybridation de l’amorce avec le brin d’ADN correspond au nombre de base C-G et A-T. Plus il y a de C-G est plus la température d’hybridation est élevé et donc plus elle est sélective. Si la température est trop basse il risque d’y avoir des appariements non spécifique entrainant ainsi des