TECHNOLOGIES BIOCHIMIQUES ET BIOLOGIQUES

TRAVAUX PRATIQUES

SUJET 21

Durée : 7 heures Coefficient : 9

BIOCHIMIE (8 points) Durée : 3 heures

DETERMINATION DES CONSTANTES CINETIQUES
KM et Vmax
D’UNE ENZYME

L’enzyme étudiée est la phosphatase alcaline.
On utilise la cinétique d’hydrolyse du PNPP (paranitrophényl phosphate) à 30°C et à pH = 9,8.

PNPP + H2O ----------------- PNP + Phosphate

Le PNP (paranitrophénol) jaune en milieu alcalin est dosé par photométrie d’absorption moléculaire à 405 nm.

1. GAMME ETALON DE PARANITROPHENOL

On dispose d’une solution de PNP à 0,1 mmol.L-1
Préparer une gamme d’étalonnage dans les tubes à essais, selon le tableau ci-dessous :

Tube n°
0
1
2
3
4
5
Solution de PNP à 0,1 mmol.L-1 (en mL)
0
1
2
3
4
5
Tampon pH = 9,8 (en mL)
5
4
3
2
1
0
Solution d’hydroxyde de sodium à 2,5 mol.L-1 (en mL)
1
1
1
1
1
1
Eau distillée (en mL)
4
4
4
4
4
4

Lire les absorbances à 405 nm.
2. DETERMINATION DES CONSTANTES CINETIQUES DE LA REACTION

Opérer comme indiqué dans le tableau ci-dessous :

Tube n°
1’
2’
3’
4’
5’
Solution de PNPP à 1 mmmol.L-1 (en mL)
0,5
0,7
1
2
4
Tampon pH = 9,8 (en mL)
3,5
3,3
3
2
0
Préincuber à 30°C
A t = 0 : Solution de phosphatase alcaline préincubée à 30°C (en mL)
1
1
1
1
1
Incuber à 30°C
Au bout de 6 minutes exactement : Arrêter la réaction pour chaque tube, par addition rapide et homogénéisation immédiate de 1 mL de solution d’hydroxyde de sodium à 2,5 mol.L-1
Eau distillée (en mL)
4
4
4
4
4

Lire les absorbances à 405 nm contre un blanc de composition suivante :
4 mL de tampon pH = 9,8
1 mL de solution de phosphatase alcaline
1 mL de solution d’hydroxyde de sodium à 2,5 mol.L-1
4 mL d’eau distillée

3. RESULTATS

Compléter la fiche de résultats.
FEUILLE A RENDRE AVEC LA COPIE

FEUILLE DE RESULTATS

1. GAMME ETALON DE PNP

1.1. Compléter le tableau

Tube n°
0
1
2
3
4
5
Concentration molaire en PNP dans le tube de gamme en mmol.L-1

Absorbance (A) à 405 nm