Le but de ce TP est de vérifier la spécificité pour l’adénine de la dépurination par hydrolyse alcaline, de détecter et de doser ces sites abasiques crées dans une solution de dAMP, puis d’utiliser ces principes pour doser un oligonucléotide et donc mettre en évidence avec le lien avec le nombre d’adénines présentes dans la séquence.Nous pourrons déterminer ces dosages grâce à l’absorbance du BCA (acide bicinchoninique) à 562nm. `Principe :Nous allons réaliser une hydrolyse alcaline de désoxyribonucléotides avec de la soude (NaOH), pendant 10mn à 90°C. cette hydrolyse devrait avoir un effet spécifiquement sur les adénines. L’effet produit de cette hydrolyse sur les adénines devrait être une dépurination, c’est-à-dire une rupture de la liaison n-osidique …afficher plus de contenu…

Pour cela, il suffit juste de faire varier le volume de dAMP apporté dans les tubes. Nous allons ainsi réaliser une gamme étalon traduisant la relation entre l’absorbance calculée et la concentration en dAMP. Il faut néanmoins calculer l’absorbance corrigée, en soustrayant l’absorbance mesurée à l’absorbance du tube n°1, qui correspond à l’essai à blanc (tube contenant tout sauf la molécule à doser). Cette droite étalon pourra ainsi nous donner la concentration en adénine dans une séquence d’oligonucléotide en fonction de l’absorbance à 562nm mesurée.Pour vérifier l’efficacité de l’hydrolyse sur les liaisons n-osidiques des adénines, nous allons réaliser une seconde droite étalon avec un sucre réducteur modèle, le …afficher plus de contenu…

Série 1 TMP dGMP DCMP dAMP 0 0 5.0000000000000001E-3 0.25700000000000001 Colonne2 TMP dGMP DCMP dAMP Colonne3 TMP dGMP DCMP dAMP Absorbance (562nm)Gamme-étalon representant la variation de l'abs562 en fonction de la concentration en dAMP Valeur des Y 0 0.3 0.5 0.7 0.9 0 0.05 0.115 0.14499999999999999