Lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d'affinité

La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme présente dans une grande diversité d'organismes, aussi bien végétaux qu'animaux. Elle catalyse la conversion réciproque de la pyruvate et de la lactate accompagnée de la conversion concomitante du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de 4 sous unité (isoenzyme) différents de par leurs constance cinétiques et leurs pH isoélectriques.

Le but de ce TP est de purifier la LDH (ici de façon partielle) au moyen d'une chromatographie d'affinité en colonne.

Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur l'attirance entre l'enzyme et sont substrat. On choisit ici d'isoler l'enzyme sur gel de cibacron analogue du NAD+ (bleu de cibracron fixé par covalence à une phase stationnaire dans une colonne). L'enzyme se fixe alors de manière non covalente au bleu, laissant ainsi les impureté (autres protéines) passer entre les maille du gel de cibracron et être éluées en dehors de la colonne, la purification ne sera partielle car le bleu de cibracron est relativement peu spécifique de la LDH, en effet il est spécifique à un groupe de protéine. On récupère enfin l'enzyme après lavage avec un éluant avec un tampon content du NADH et de l'acide oxamique : un analogue du pyruvate. L'acide oxamique créera avec l'enzyme une liaison covalente cette fois beaucoup plus forte que celle créée entre l'enzyme et le bleu de cibacron, permettant ainsi d'arracher du gel au moyen d'une élution par compétition, on obtient