TP4 EFFET DE LA TEMPERATURE SUR LA PHOSPHATASE ALCALINE
OBJECTIF : étudier l'influence de la température sur la vitesse de la réaction enzymatique ainsi que la stabilité de l'enzyme soumise à une température dénaturante.
1. ORGANIGRAMME
Conditions opératoires pour les manipulations :
Tampon TGN pH = 10,5
Températures de mesure d'activité = 37°C ou variable
Volume réactionnel 2,5 mL dont 0,05 mL de PAL
Cinétique en 2 points Δt = 2 minutes
Réactif d'arrêt : NaOH, volume de lecture au spectrophotomètre …afficher plus de contenu…

Les lectures seront effectuées contre un blanc-réactifs (temps t = 0) sans enzyme mais contenant du
PNPP préincubé, incubé et additionné de soude, selon les conditions opératoires.
4. EXPLOITATION DES RESULTATS
4.1. Vm - f (température)
– Tracer la courbe ΔA / minutes = f (température de réaction), la commenter et l'analyser ; déterminer la température optimale
– En utilisant astucieusement un tableur-grapheur, tracer la courbe : In(ΔA/minute) = f(1/T(en
Kelvin) pour les températures correspondant à la partie ascendante de la courbe précédente (loi d'Arrhénius) Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 2/4– Déterminer l'énergie d'activation (au sens d'Arrhénius) de la réaction …afficher plus de contenu…

Suivre la réaction 1min à l'aide du menu cinétique du spectrophotomètre Ultrospec Pharmacia (à programmer). Valider la phase stationnaire de chaque essai, en déduire la ΔA/min ; valider la répétabilité des résultats selon la procédure ISO 5725-6 ; avec σr = 0,002,unités d'absorbance/min.
Déerminer la concentration catalytique en U/mL d'enzyme. Exprimer l'incertitude ; incertitude type : CV =
4 %.
Donnée de la photométrie d'absorption moléculaire : blanc réactif = air ou réactif à t= 0
Cinétique de préincubation
Verser 2,5 mL d'eau déminéralisée (à température ambiante) dans un tube. Y placer un thermomètre
(également à température ambiante : noter la