TP 1 : SEPARATION DE L’ALANINE ET DE L’ARGININE SUR RESINE ECHANGEUSE D’IONS

1. BUT

Ce TP consiste à séparer deux acides aminés constitutifs d’un peptide : l’alanine et l’arginine par une hydrolyse puis par chromatographie sur échangeuse d’ions, puis d’effectuer le dosage de l’alanine et la mise en évidence de l’arginine.

2. PRINCIPES

Nous réaliserons pour commencer le TP, l’élution de l’alanine afin de pouvoir la doser.

La chromatographie échangeuse d’ions est un type de chromatographie en phase liquide permettant d’isoler une substance chargée électriquement d’un mélange de molécules chargée (liquide).
Elle est composée de deux phases : * Phase stationnaire : l’amberlite IRC 50 * Phase mobile : le tampon acétate 0,1 mol/L pH 4,2 faisant migrer les acides aminés.
On fait passer le mélange sur une phase stationnaire solide (résine échangeuse d’ions) chargé déjà associé à des ions connus, et on remplace ces ions par les ions/molécules chargés du mélange à chromatographier.
Ici la résine échangeuse d’ions est l’amberlite IRC 50 qui possèdent un groupement carboxylique, c’est donc un échangeur de cations qui retiendra les acides aminés sous leur forme cationique. De plus le pH de la solution étant fixé (4,2), si la charge des acides aminés est nulle voire négative devant le pH, ils seront peu ou pas retenus, au contraire si leur charge est positive ils seront retenus (pH du tampon inférieur au pHi des acides aminés). L’élution pourra ensuite être réalisée en augmentant le pH du tampon.

Son dosage repose sur l’apparition d’une couleur pourpre due à la condensation de NH3, libéré par l’acide aminé, et d’une molécule de ninhydrine et d’hydrindantine. Apres préparation des différents tubes pour l’analyse, nous effectuerons une lecture de l’absorbance, mesurée par un spectrophotomètre. Plus l’espèce est concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalités. Il faut donc au préalable déterminer la longueur d’onde