LA LACTATE DÉSHYDROGÉNASE

La lactate déshydrogénase ou LDH est une enzyme qui catalyse la réaction suivante :
L-lactate + NAD⁺ <==> pyruvate + NADH + H⁺

Cette réaction permet pour la plupart des mammifères et des bactéries de faire de la fermentation lactique soit la réoxydation des cofacteurs (ici NADH,H⁺) en anaérobiose.

Objectif :

L'objectif de ce travail pratique est de purifier une protéine, en l'occurrence la LDH mais de façon partielle à partir d’un extrait cellulaire de tissu bovin foetal au moyen d’une chromatographie d’affinité sur bleu Cibacron.

(le bleu Cibacron a une structure proche du NAD⁺ qui est un cofacteur de la réaction impliquant la LDH d'où son utilisation)

Principe de la chromatographie d’affinité :

Il existe différents types de chromatographie liquide (d'exclusion, d'affinité, échangeuse d'ions et hydrophobe). Nous avons utilisé la chromatographie d’affinité car c’est la plus sélective puisqu’il y a complémentarité entre le ligand (le bleu Cibacron) et la protéine (la LDH).
On choisit ici d'isoler l'enzyme, LDH sur gel de Cibacron qui est analogue du NADH. D’abord, on remplit la colonne de gel de bleu Cibacron qui se fixe par covalence à une phase stationnaire poreuse à la base de la colonne. Ensuite, on fait une équilibration avec un tampon de lavage afin de mettre le gel dans des conditions les plus optimales possible. Vient ensuite la fraction de départ ou l'extrait que l'on dépose dans la colonne pour qu'ainsi seul la LDH reste fixée au bleu Cibacron, laissant les autres protéines passer à travers le gel que l'on récupère pour obtenir la fraction non retenue.
On fait par la suite un lavage de la colonne qui va permettre d’éliminer les protéines faiblement lié au ligand pour obtenir la fraction de lavage.
Enfin, on ajoute un tampon d'élution contenant du NADH et de l'acide oxamique (analogue du pyruvate) qui va permettre de récupérer l’extrait enzymatique car l'acide oxamique va créer avec