MARQUAGE RADIOACTIF ET A FROID DES ACIDES NUCLEIQUES

Une petite définition pour se situer… • Le marquage consiste en l’incorporation d’un atome ou groupement possédant des propriétés particulières permettant sa mise en évidence expérimentale : radioactivité, fluorescence (fluoresceine ou rhodamine), ligand (biotine) ou des molécules antigéniques ( digoxygénine). Ainsi, selon la nature de ce dernier, on distingue :
-Marquage radioactif dit chaud -Marquage froid dit biochimique I/ Marquage de l’ADN A)-Marquage radioactif
L’atome ou le groupement incorporé est RADIOACTIF (ajout d’un radio isotope tel que 32P, 35S, 3H).
L’incorporation du marqueur peut se faire soit -->Uniformément : Marquage interne -->Aux extrémités : Marquage externe
Pour la Révélation : Les produits marqués seront détectés facilement grâce à l’autoradiographie qui consiste à imprégner un film photographique par le rayonnement radioactif. 1 )-Marquage Interne :
-Nick translation ou déplacement de cassures
Utilisation de 2 enzymes :
- DNAse I dans des conditions ménagées pour générer quelques coupures simple brin dans le fragment d'intérêt
-DNA pol.I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nucléotide chaud.
L’ADN double brin traité par la DNAse I est clivé au hasard. La réparation des coupures réalisées par la DnAse I nécessite l'action de l'ADN polymérase I en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au phosphore radioactif (32P). Les désoxynucléosides triphosphates utilisés sont marqués en position alpha au 32P.
-Random- priming ou marquage par amorçage au hasard
Chauffage suivi d'un refroidissement brutal des deux brins d’ADN.
On ajoute un mélange d'oligonucléotides (hexanucléotides) de synthèse correspondant à toutes les combinaisons mathématiquement possibles (soit 46 = 4096 nucléotides).