Léonard a représenté la Cène : le dernier repas de Jésus de Nazareth entouré de ses douze apôtres, le jeudi saint, veille de sa crucifixion. Il suit là une vieille tradition monastique. Depuis le Moyen Âge les murs des réfectoires sont illustrés de la Cène. « Ainsi, durant leur repas, les moines avaient-ils sous les yeux, (…) l’image de celui que partagea leur Seigneur pour la dernière fois[1] ».
Grâce à une copie contemporaine de la Cène[2], nous pouvons identifier chacun des personnages. Il s’agit, de gauche à droite, de Barthélemy, Jacques le Mineur, André, Judas, Pierre, Jean, Jésus, Thomas, Jacques le Majeur, Philippe, Matthieu, Thaddée et Simon. La fresque est surmontée des trois blasons de la dynastie des Sforza. Au centre celui de Ludovic Sforza et de son épouse, Béatrice d’Este, à gauche, celui de son fils aîné, Massimilo et à droite, celui de son autre fils, François.
Léonard reprend une innovation apparue au milieu du Quattrocento, chez Andrea del Castagno pour Santa Apollonia, ou Domenico Ghirlandaio, pour les Ognissanti : la perspective de la fresque prolonge la salle réelle du réfectoire par le trompe-l’œil du plafond à caissons et des murs latéraux recouverts de tapisseries.
Une série d’incisions encore visibles a servi à Léonard de Vinci pour tracer les lignes de fuite de la perspective. Un trou au niveau de la tempe droite du Christ correspond au point de fuite principal. Ainsi, le Christ occupe-t-il une position centrale à la fois par rapport aux apôtres, mais aussi par rapport au mur du fond de la fresque, comme un second tableau dans le premier. Les apôtres eux-mêmes sont répartis symétriquement par rapport au Christ, en quatre groupes de trois, mais les groupes sont dissymétriques entre eux, donnant ainsi de l'animation à la scène.
Une grille de perspective très géométrique et régulière que Léonard abandonne ensuite comme principe de construction de ses tableaux.
Il en exploite les limites dans ce tableau : la table et les apôtres semblent