DETERMINATION DE LA VITESSE INITIALE D'UNE REACTION ENZYMATIQUE
COURBE [P] = f (t)
I. PAR METHODE CINETIQUE
L'enzyme étudiée est la phosphatase alcaline qui catalyse l'hydrolyse des liaisons esters lorsque l'acide engagé est l'acide phosphorique mono estérifié.
On utilise la cinétique d'hydrolyse du PNPP (ParaNitroPhényl Phosphate) à 20°C à pH=9,8.
Le PNP (ParaNitroPhénol) est jaune en milieu alcalin. On peut donc suivre l'apparition du PNP au cours de l'hydrolyse en enregistrant l'absorbance du mélange réactionnel à 410 nm en fonction du temps.
1. SPECTRE D'ABSORPTION DU PNP
A partir d'une solution de PNP, en tampon DEA pH=9,8, à 0,04 mmol/L, tracer le spectre d'absorption du PNP entre 300 et 500 nm (réaliser les mesures d'absorbance tous les 10 nm, puis tous les 5 nm au voisinage de lmax).
Le zéro du spectrophotomètre sera réalisé sur une cuve contenant du tampon DEA pH=9,8.
2. COURBE [P] = f(t)
Dans une cuve spectrophotométrique propre et sèche introduire:
-1mL de solution de PNPP à 5 mmol/L
-1,5 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
Noter l'évolution de l'absorbance à 410 nm pendant 10 minutes (les valeurs d'absorbance seront relevées toutes les minutes). Le zéro du spectrophotomètre sera réalisé grâce à un blanc de composition suivante:
-1 mL d'eau distillée
-1,5 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
3. RESULTATS
-Tracer le spectre d'absorption du PNP: A = f(l en nm).
-Déterminer lmax.
-Calculer ePNP à 410 nm.
-Tracer la courbe A = f(t en min).
-Calculer la vitesse initiale de la réaction (vi) en mol / L de mr / min (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme).

II. PAR METHODE POINT PAR POINT
L'enzyme étudiée est la b fructosidase qui est une hydrolase capable de scinder les liaisons b fructofuranosiques.
La réaction utilisée est l'hydrolyse du saccharose (glucide non réducteur) en fructose et glucose (glucides réducteurs)
en