Analyse d’un fractionnement sub-cellulaire par la recherche d’activités d‘enzymes marqueur

Introduction

Un fractionnement cellulaire de tissus hépatique a été réalisé. Cinq fractions cellulaires ont été obtenues après centrifugation. Ces différentes fractions correspondent respectivement à l’ensemble cellulaire sans le noyau (F1), le cytosol et les microsomes (F2), les mitochondries (F3), l’ensemble du système endomembranaire (F4) et le cytosol contenant les protéines solubles (F5).
Lors du TP, les différentes fractions ont été soumises à différents dosages d’activités enzymatiques telles que l’activité de lactate déshydrogénase, l’activité de la glucose-6-phosphatase, l’activité de la cytochrome C oxidase.
Ces dosages nous ont permis de mettre en évidence la localisation subcellulaire de l’enzyme dosée.
Ce TP nous a permis de définir ce qu’est une enzyme marqueur et de replacer chacune des activités dosées dans leur voie métabolique.

Matériel et méthodes

1- Réalisation de gamme étalon (incubée en même temps que les milieux réactionnels)

Lors de la recherche de l’activité de la glucose-6-phosphate, 9 tubes avec une quantité de Pi allant de 0 à 20 µg ont été préparé à partir d’une solution mère de KH2PO4 1mM de la façon suivante :
Le témoin négatif a été préparé avec 500µL d’eau.
Pour la préparation une solution contenant 1µg de Pi, 10,5µL de KH2PO4 1mM ont été ajouté à 489,5 µL d’H2O. Toujours à partir de la solution mère de KH2PO4 1mM, des dilutions contenant une quantité de Pi de 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 ont été réalisées de la même manière pour obtenir un volume final de 500µL.

Lors du dosage des protéines, une gamme étalon allant de 0µg à 25µg de BSA a été réalisée à partir d’une solution mère de BSA à 1mg/mL.
Un témoin négatif a été préparé avec 2mL de Réactif de Bradford 1X.
Pour la préparation d’une solution contenant 5µg de BSA, 5 µL de solution mère de BSA ont été ajouté à 1,995 mL de Réactif de Bradford.
Toujours