Compte rendu du TP de Structure et Fonction des Protéines (BIO71).

Purification et Stabilité de la Thrombine.

Résumé:

Ce TP a pour but de purifier et de tester la stabilité de la thrombine, enzyme de la coagulation sanguine. La purification de la prothrombine comporte normalement 3 étapes: précipitation au chlorure de baryum, dialyse et chromatographie échangeuse d'ions.
Au cours de ce TP, nous avons pu réalisé que 2 de ces étapes: la précipitation et la chromatographie car l'étape de dialyse prend trop de temps. Durant la 1° étape, nous avons utilisé une méthode de précipitation au chlorure de baryum (BaCl2), ce qui nous a permis d’isoler de la prothrombine à partir de plasma sanguin.
La dernière étape de purification de la prothrombine est une chromatographie échangeuse d’ions sur une colonne de diéthyl-amino-éthyl DEAE chargée positivement.
Au cours de ce TP, nous avons donc pu isoler la prothrombine du plasma équin.

Introduction:

La thrombine (facteur II activé) est produite par le clivage de deux sites de la prothrombine qui est une protéine de la coagulation sanguine.
La thrombine est l'estérase terminale de la coagulation qui permet la transformation du fibrinogène en fibrine. C'est également un puissant agent activateur plaquettaire. La thrombine possède des propriétés activatrices sur différents types cellulaires: par exemple les Protease Activated Receptors (PAR). Elle agit en clivant partiellement ces récepteurs.
La thrombine induit notamment la prolifération des cellules musculaires lisses, des fibroblastes et des cellules endothéliales en induisant la production de facteurs de croissance tels que le fibroblast growth factor (FGF), le vascular endothelial growth factor (VEGF) et leurs récepteurs.
La thrombine possède également des propriétés pro-inflammatoires telles que la production de prostaglandines, du facteur d'activation plaquettaire (PAF) ou l'expression de la P-sélectine.

Méthodes:

La précipitation au chlorure