Procédés de séparation et méthodes d'analyse des protéines

Introduction :
Les protéines peuvent être séparées selon leur taille mais aussi selon leur charge. Suivant le paramètre pris en compte, nous effectuerons soit une chromatographie d'exclusion, soit une chromatographie échangeuse d'ion. (1ère séance) Deux méthodes d'analyse des protéines ont été testées séparément, afin d'estimer dans un premier temps la taille de protéines et dans un second temps, la concentration protéique de solution. (2ème séance)

Première séance : chromatographie échangeuse d'ion
Méthodes : Nous avons mis en place une chromatographie échangeuse d'ions, afin de séparer deux protéines de tailles voisines mais de pI différents : la subtilisine (pI=9,4) et la pepsine (pI<1) qui sont mises en solution dans un tampon phosphate à pH=6,1. La colonne échangeuse d'ion contient un support solide de type carboxymethyl-sépharose; il s'agit d'une résine de charge négative, échangeuse de cation. On y ajoute la solution contenant nos deux protéines et du tampon 1X. On collecte les gouttes qui s'écoulent réparties dans 5 fractions. Puis on ajoute dans la colonne du tampon 1X NaCl et on collecte les gouttes qui s'écoulent dans 5 autres fractions. Par la suite, on mesure l'absorbance des 10 fractions.

Résultats et interprétation : voir annexe 1 : tableau + histogramme
Les deux protéines sont contenues dans une solution à pH=6,1. La pepsine a son pI<pH donc elle est sous la forme anionique dans la solution. La résine CM-sépharose retient les cations. La pepsine ne se fixe donc pas à la résine. La subtilisine ayant son pI> au pH, se retrouve sous la forme cationique. La résine CM-sépharose permet de retenir les cations. Ainsi il y a une forte interaction ionique entre la subtilisine et la résine. Afin de les séparer, il faut augmenter la force ionique du tampon, il faut donc introduire des sels (NaCl). Les sels seront donc en compétition avec la protéines pour se fixer sur la résine.