Introduction : La nitrate réductase est une enzyme (ou complexe enzymatique en réalité) végétale qui permet de catalyser la réduction des nitrates. La nitrate réductase permet cette réduction jusqu’au stade diazote (gazeux), mais surtout la réduction des nitrate jusqu’au stade nitrite selon la réaction suivante : NO3- + 2H+ + 2e- -> NO2- + H2O. Les nitrites seront ensuite réduits en ammoniac grâce à la nitrite réductase.
C’est cette réaction que nous allons suivre lors de ce TP dont le but est de déterminer l’activité de la nitrate réductase dans des feuilles de cresson et de voir que cette activité est inductible par la lumière.
Pour cela, nous allons dans un premier temps préparer un extrait enzymatique grâce à des feuilles de cresson, nous mettrons ensuite en évidence la nitrate réductase avant de doser les nitrites apparus par spectrophotométrie. Puis, après avoir dosé les nitrites présents dans l’extrait enzymatique, nous calculerons la quantité réelle de nitrite issue de l’activité de la nitrate réductase et compareront les 2 traitements : lumière et obscurité.

I - Matériel et méthode :

• Matériel :
Le matériel que nous avons utilisé au cours du TP est listé et présenté ci-dessous. * Feuilles de cresson alénois (Lepidium sativum) mis à l’obscurité 4 jours avant le TP (le vendredi). Nous avons utilisé 1,72g de tissu végétal. * Solution de tampon tris 0,05M, pH 7,4, EDTA 0,1M, FAD25µM. * PVP (polyvinylpyrolidone) * Mixeur * Centrifugeuse * Bac de glace * 4 tubes à hémolyse * Solution de KNO3 à 0,1M * Solution de NADH à 5mM * Bain-marie 30°C * Filtre millipore * spectrophotomètre * Solution d’acide sulfonique à 10g/L * Solution de N1-naphtyl à 0,2g/L

• Méthode
Dans un premier temps, nous nous sommes partagés le travail entre les binômes à cause du manque de matière fraiche causé par la dégradation du matériel végétal due à l’utilisation d’un terreau infecté. Nous avons ensuite coupé et